中药不同配伍对心衰影响研究

慢性心力衰竭( CHF) 是各种心血管疾病的终末阶段，因其再住院率高，存活率低，严重影响了患者的生活质量，已成为心血管疾病的主要死亡原因。尽管目前 CHF 的治疗已取得了较大的进步，但全球共有2300 万人患心力衰竭，其发病率占总人口的 3. 9%［1］，并且西药治疗慢性心衰价格昂贵，这都增加了患者家庭和社会的经济负担。笔者通过临床观察发现，益气、活血、利水中药能够改善慢性心衰患者症状和远期预后，延缓心力衰竭进展。然而对益气、活血、利水中药治疗慢性心衰的作用靶点却缺乏足够的了解，有关这方面的动物实验研究也比较少，因此，本实验研究中药干预慢性心衰发生发展的分子生物学机制，从慢性心衰大鼠心室重构的保护作用并着重从 MMP － 2、TIMP － 2 方面探讨其作用机制，积极寻找中医药防治慢性心衰的新思路。

1 材料与方法

1. 1 实验动物与分组 普通级 12 周龄健康 wistar 雄性大鼠，100 只，体重在 200 ～250g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。造模成功的大鼠分为模型组、西药组、益气中药组、活血中药组、益气活血中药组和益气活血利水中药组; 没有进行左冠脉结扎手术的假手术大鼠为正常组。每组各 10 只大鼠。

1. 2 实验药品 益气组药物: 由黄芪、人参 2 味中药组成; 活血组药物: 丹参、三七粉、益母草 3 味药组成;益气活血组药物: 由黄芪、人参、丹参、三七粉、益母草五味药组成; 益气活血利水组药物: 由黄芪、人参、丹参、三七粉、益母草、茯苓、葶苈子七味药物组成。中药复方制剂: 由江阴天江药业有限公司提供; 处方中的全部药材均符合《中华人民共和国药典》2005 年版有关规定。赖诺普利片: 由上海信谊万象药业股份提供，每片 10mg; 国药准字: H10960265。

1. 3 主要试剂及仪器 MMP － 2、TIMP － 2 免疫组化试剂盒，由博士德生物工程有限公司提供; AO 石蜡切片机由 SCientifieinstruments 生产; SONO S5500 彩色多普勒超声机由 Agilnet 公司生产; BS － 51 显微镜由日本奥林巴斯公司生产; 碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG、MMP － 2、TIMP － 2 抗体购自北京中山生物技术有限公司。

1. 4 造模方法 普通级 12 周龄健康 wistar 雄性大鼠，100 只，经过 1 周适应性喂养。大鼠经 10% 水合氯醛 0. 5 ～0. 8mL /100g 腹腔麻醉后，背位固定，经喉气管插管术连接小动物呼吸机进行人工呼吸，频率 50 ～55 次 / min，潮气量 0. 7 ～ 0. 8mL，用针形电极刺入四肢及胸壁皮下与心电图机相连，描记正常心电图( 图 1)。消毒后左胸第 3 ～4 肋间开胸，横向切开皮肤长约1. 5cm，钝性分离局部软组织，可见胸骨及肋软骨，继续沿 3 ～4 肋间隙打开胸腔，用眼科小镊子轻夹上提心包膜，小剪子剪开心包膜暴露心脏，用镊子轻提左心耳，于冠状动脉左主干起源点 2 ～4 mm 处用 6 号缝线结扎，心电示波器显示胸前导联 ST 段及 T 波有明显异常改变( 胸前导联 ST 段显著提高，T 波高耸) ( 图2) ，重置心脏于胸腔，迅速分层用 3 号缝线缝合胸壁，并于手术伤口处敷以青霉素钠，待动物状态平稳后，停用呼吸机。为大鼠口腔清痰，同时注射青霉素钠 20 万U / ( 次 • d ) ，持续1 周 ，以防止感染 。常规喂养1周后，于第 2 周将其饲料减半，使其饥饿，同时每天游泳至其疲乏，日 1 次，共 4 周。经多普勒超声心动图检测( 见插页图 3 ～4) ，以计算左室射血分数 EF 值≤40%作为心衰模型成功的标志，同时大鼠出现体重减轻，精神萎靡，毛色无光泽，列入观察对象。

1. 5 给药剂量 正常组及模型组不加任何药物处理因素，每日 1 次灌服等容积蒸馏水。用药各组的大鼠按人鼠剂量换算，给药剂量( g/kg) = 给出的人的剂量( g) × 系数( 0. 018) /所求动物体重( kg) 。中药组4. 6g 生药( kg•d) ; 西药组，赖诺普利片以等效剂量计算 6. 75mg 生药( kg•d) ，各组均用药 4 周。

1. 6 实验取材 在对大鼠灌喂不同药物( 模型组、假手术组灌服蒸馏水) 6 周后，禁食不禁水 12h，麻醉处死全部大鼠。每组取 10 只大鼠心脏心肌组织，每只大鼠心脏按标准处理，且分成两份，每份标本取 100mg心肌组织，并于液氮中冷冻后在 － 80℃条件下保存待测。第一份用于实时定量荧光 PCR 技术检测 MMP －2、TIMP － 2 基因表达程度; 第二份用于 SABC 免疫组化法光镜下观察心肌组织变化情况。取材后冰生理盐水清洗血液，准备用于显微镜观察，再用并利用Image － Pro Plus 图像分析软件( 美国 MEDIA CYBER-NETICS 公司) 进行半定量测定，计算每张切片的平均灰度值。

1. 7 统计学处理 应用 SPSS 15. 0 版软件进行统计分析，所测得数据均以(珋x ± s) 表示; 各组均数比较采用方差分析( one － way ANOVA) 。经方差分析，组间总体差异有意义，且满足正态性和方差齐性时，两两比较用 LSD 法; 方差不齐时，选用 Dunnett’s T3 法。P ＜0. 05 为有统计学意义，P ＜ 0. 01 为有显著差异，P ＞0. 05 为无统计学意义。

2 结 果

2. 1 益气、活血、利水不同中药复方对慢性心衰大鼠心肌组织 MMP － 2 mRNA、TIMP － 2 mRNA 表达的影响 详情见表 1; MMP －2、TIMP －2 的实时荧光定量PCR 溶解曲线，扩增曲线见插页图 5 ～ 10。

2. 2 免疫组化法分析益气活血利水不同中药复方对慢性心衰大鼠心肌组织 MMP － 2、TIMP － 2 表达的影响 详情见表 2。

3 讨 论

祖国医学将慢性心衰归属于“胸痹心痛”、“真心痛”、“喘证”、“水肿”等范畴。其基本病机总属本虚标实，本虚以气虚、阳虚为主，标实则以血瘀、痰饮最为重要。气虚血瘀是贯穿于慢性心衰的主要病机，益气活血利水是其治疗大法。笔者采用以黄芪、人参、丹参、三七粉、益母草、茯苓、葶苈子为主要成分的益气、活血、利水中药复方治疗慢性心衰，其中参芪桂益气通阳，三七、丹参、益母草活血化瘀，葶苈子泻肺利水，茯苓健脾以利水，且益母草既活血又利水，切中心衰病机。诸药合用，健脾益气、活血化瘀、利水通脉。本次实验采用免疫组化法、实时荧光 PCR 技术检测大鼠心肌中 MMP － 2、TIMP － 2 蛋白和基因的表达水平，发现慢性心衰大鼠模型组 MMP －2 表达明显升高( 与假手术组比较 P ＜0. 01) ; 经药物干预后各治疗组 MMP －2 明显下降，其中西药组、益气活血组、益气活血利水组 3 组有疗效( P ＜ 0. 01) ，但西药组与各中药组疗效无差异( P ＞ 0. 05) ，益气活血利水组疗效明显优于益气活血组 ( P ＜ 0. 01) 。模型组 TIMP －2mRNA 表达明显降低( 与假手术组比较 P ＜ 0. 01) ; 经药物干预后各治疗组 TIMP － 2 明显升高，其中西药组、益气活血组、益气活血利水组 3 组有疗效( P ＜0. 01) ，但西药组与各中药组疗效无差异( P ＞ 0. 05) ，益气活血利水组疗效优于益气活血组( P ＜0. 05) 。

综上所述，益气活血利水全方效果最优，这不仅体现了中医组方配伍是在辨证论治的基础上，针对病因病机，有轻重主次的安排药物组合成方，更是着重从MMP － 2、TIMP － 2 方面阐发中医药治疗慢性心衰作用靶点。